公開衝突在1542年重新爆發，法奧合作也得以恢復。

1541年7月4日，法國駐奧斯曼帝國大使安東尼奧·林孔（Antonio Rincon）在經過義大利帕維亞（pavia）附近時被帝國軍隊暗殺，導致了新的衝突爆發。

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在1542-1546年義大利戰爭期間，弗朗西斯一世和蘇萊曼大帝再次與神聖羅馬帝國皇帝查理五世以及英格蘭國王亨利八世（henry VIII）對峙。

戰爭期間，義大利、法國和低地國家（Low countries）爆發了激烈的戰鬥，同時還嘗試入侵西班牙和英格蘭。

儘管這場衝突對主要參戰國來說代價極其高昂，但結果並未有明確的勝負。

在地中海，應弗朗西斯一世的請求，兩國在安託萬·埃斯卡林·德·艾馬爾（Antoine Escalin des Aimars，又名波林船長）轉達後，積極進行海軍合作，以對抗西班牙軍隊。